华北农学报

作者：杨迪, 黄玲巍, 杨雅雯, 乔自林, 王家敏

单位：1 西北民族大学 生物医学研究中心,细胞基质疫苗关键技术与产业化教育部工程研究中心,甘肃 兰州 730030；2 甘肃农业大学 动物医学院,甘肃 兰州 730070；3 西北民族大学 生物医学研究中心,甘肃省动物细胞技术创新中心,甘肃 兰州 730030；4 西北民族大学 实验教学部,甘肃 兰州 730030

关键词：犬肾细胞系,表皮生长因子受体,慢病毒载体,

基金：甘肃省科技计划项目(22JR11RA239); 甘肃省科技计划项目(23YFFA0071); 中央高校基本科研业务费资金专项(31920230001)

表皮生长因子受体(EGFR)在许多实体肿瘤中过度表达,建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株,有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体,与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞中,48 h后提取上清液经纯化获得EGFR基因过表达慢病毒液。将其转染至MDCK细胞中,经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆后观察感染效率,RT-qPCR和Western Blot、间接免疫荧光分别检测基因及蛋白的表达,建立EGFR蛋白过表达MDCK细胞株。使用流式细胞仪分别检测过表达及对照细胞株的细胞凋亡和细胞周期。犬EGFR基因位于18号染色体,由编码跨膜糖蛋白的30个外显子组成。经反应体系,PCR产物交换入线性化表达载体,获得了阳性转化子8个,大小为738 bp。所获EGFR基因过表达慢病毒滴度为 3.5×108 TU/mL。转染MDCK细胞后在荧光显微镜下观察荧光效果显著,经检测EGFR基因及其蛋白在细胞中的表达量显著升高。间接免疫荧光试验显示,EGFR在细胞中表达明显增强。过表达细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率显著上升,且在G2/M期发生阻滞。成功建立一株稳定的犬EGFR过表达MDCK细胞株,犬EGFR的过表达催化了细胞分裂,使DNA复制加快,同时刺激了细胞凋亡。

来源：2024年第4期

《华北农学报》期刊编辑部

查看华北农学报杂志2024年第4期