华北农学报

作者：宿放, 韩佃刚, 叶玲玲, 张冲, 尹尚莲, 罗倩敏, 董仙兰, 李瑶瑶, 李凌枫, 艾军, 信吉阁

单位：1 云南农业大学 动物医学院,云南 昆明 650201；2 昆明海关,云南 昆明 650200

关键词：COVID-19病毒,N蛋白,昆虫表达系统,重组杆粒,蛋白鉴定,

基金：云南省院士专家工作站(2018IC078)

为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中,首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白(N蛋白)序列,将pFastBacTMHTB载体上的酶切位点BamH Ⅰ和Xba Ⅰ分别加入上下游引物,利用PCR技术对N基因进行扩增,先后连接T-Vector pMD19(simple)载体与pFastBacTMHTB载体,并获得重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N和pFastBacTMHTB-COV19-N,最终在DH10Bac细胞中构建重组杆粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N并使其在昆虫细胞Sf9内进行表达,获得重组蛋白后进行SDS-PAGE和WB分析。通过PCR方法成功扩增N基因,构建的重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N经PCR和双酶切鉴定均证明正确,在DH10Bac细胞内构建的重组杆粒DH10Bac-pFastBacTMHTB-COV19-N通过PCR鉴定得到预期2条带,大小分别为2 430,3 690 bp,证明成功得到重组杆粒,用该重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,同时设立重组GFP蛋白对照组,转染120 h后分别收集重组N蛋白与重组GFP蛋白并制样;分别进行SDS-PAGE和WB分析,使用HRP-His标记抗体验证转染成功且重组N蛋白与重组GFP蛋白均在Sf9细胞内顺利表达,试验结果与预期相符,重组N蛋白条带大小约为46 ku。该试验成功构建了呼吸道冠状病毒N基因真核表达载体,并在昆虫细胞内成功表达,为建立ELISA检测方法等相关研究提供试验基础。

来源：2022年第5期

《华北农学报》期刊编辑部

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