华北农学报

作者：耿姝, 熊修琦, 李芳果, 邵颖, 殷冬冬, 涂健, 宋祥军, 祁克宗

单位：安徽农业大学 动物科技学院, 安徽 合肥 230036

关键词：禽β防御素2,细胞系,稳定表达,慢病毒载体,抗菌活性,

基金：安徽高校协同创新项目（GXXT-2019-035）；国家自然科学基金项目（31772707）

旨在建立一株稳定表达禽β防御素2（AvBD2）的细胞系，并检测细胞系分泌产物对耐药菌株的抑制效果。首先，根据同源重组设计方法设计一组含有同源臂的AvBD2基因扩增引物及载体反向扩增引物，将片段连接至pLOV-eGFP真核表达载体，构建真核重组质粒pLOV-eGFP-AvBD2，利用三质粒表达系统将重组质粒与慢病毒包装质粒pSPAX2、外膜质粒pMD2.G共转染293T细胞，收集细胞分泌上清液感染DF-1细胞，嘌呤霉素最适浓度筛选获得阳性克隆细胞系，通过RT-PCR技术和Western Blot方法对该细胞系构建结果加以验证；将细胞系分泌产物与耐药大肠杆菌菌株混合培养后，检测该蛋白抗菌效果，并通过扫描电镜观察菌体的损伤现象。结果表明，已成功构建一种稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系，其最适筛选浓度为含有1 μg/mL的嘌呤霉素的细胞培养液。该细胞系传递20代后，在mRNA转录水平及蛋白表达水平均验证正确，将细胞系的分泌产物培养耐药大肠杆菌，细菌存活率曲线显示随着培养时间的增加，细胞系上清可明显抑制耐药菌株的增殖，在培养第5小时使供试菌的存活率低于50%。扫描电镜显示供试菌体表面皱缩，存在明显损伤，而对照组菌体光滑饱满。建立了稳定表达AvBD2蛋白的DF-1细胞系，为抗生素替代品的生产制备提供探索方向，同时也为后续评价和研究AvBD2的抗菌作用奠定基础。

来源：2021年第2期

《华北农学报》期刊编辑部

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