华北农学报

作者：马铭赛, 布梁灏, 陈自银, 黄嘉玲, 欧阳乐军, 李莉梅, 王玉涛

单位：1. 喀什大学 生命与地理科学学院, 新疆 喀什 844000;；2. 新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室, 新疆 喀什 844000;；3. 广东石油化工学院 生物与食品工程学院, 广东 茂名 525000

关键词：CRISPR/Cas9,<i>ALB3</i>基因,拟南芥,基因编辑,载体,

基金：广东省攀登计划项目（pdjhb0343；pdjh2019b0323）；国家自然科学基金项目（31470677）；广东省自然科学基金项目（2019A1515010709；2017A030307017）；广东科技计划项目（2017A030303087）；大学生创新项目及培育计划项目（733163；733164；733301；733317）；自治区研究生科研创新项目（XJ2019G290）；广东省高校基础与应用基础研究重大项目（2018KZDXM047）

建立一种高效安全的基因定点编辑体系，为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA，引导Cas9蛋白识别PAM位点，从而实现ALB3基因的大片段敲除；将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中，构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体；利用农杆菌转化法转化拟南芥，对其后代进行筛选验证，在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明，含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致，由此证明载体构建成功；通过倒置荧光显微镜观察，发现阳性转化拟南芥T0种子含有红色荧光标记，表观观测以及分子鉴定表明T1植株得到纯合突变后代，条带大小小于野生型，白化突变性状明显。挑选T1不含荧光的种子进行培育得到的T2植株，经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体，并获得Cas9-Free的纯合突变植株，为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。

来源：2020年第1期

《华北农学报》期刊编辑部

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