华北农学报

作者：童文艳, 胡孟可, 徐林娜, 乔慧聪, 李芬

单位：河南师范大学 生命科学学院, 河南 新乡 453007

关键词：烟草,NtTkR,缺失和替换突变,载体构建,诱导表达,

基金：教育部留学回国人员启动基金项目（5201049130104）

已知烟草驱动家族新成员NtTkr尾部第3个卷曲螺旋（Coiled-coil，CC3）第1 084位苏氨酸（T1084）对靶蛋白的结合至关重要，通过对NtTkr尾部的酵母双杂交筛选得到多个与Ntkr互作的候选蛋白。为确定T1084缺失（T1084d）或替换（T1084A）突变对NtTkr与这些候选蛋白体外互作的重要性，首先以pBI121-NtTkr为模板，通过重叠延伸PCR扩增得到烟草NtTkr尾部T1084d、T1084A片段并将其克隆入质粒pUC19，经蓝白斑筛选、SmaⅠ-BamHⅠ双酶切鉴定后送去测序，获得正确的T1084缺失和替换的NtTkr尾部；然后将重组的pUC19-T1084d、pUC19-T1084A与pMXB10进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切，回收目的片段和载体片段并连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选得到重组子，进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切鉴定，最终成功构建pMXB10-NtTkr-T1084A和pMXB10-NtTkr-T1084d原核表达载体；最后将原核表达载体pMXB10-T1084d和pMXB10-T1084A转入BL21（DE3）中，分别经0.05，0.06 mmol/L IPTG浓度诱导，12%SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达情况，结果证明获得了NtTkr-T1084d-1317和NtTkr-T1084A-1320的成功表达，且IPTG浓度大于0.06 mmol/L时，均可高效表达约77 ku的NtTkr-T1084A-1320和76.2 ku的NtTkr-T1084d-1317蛋白量。

来源：2019年第3期

《华北农学报》期刊编辑部

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