华北农学报

作者：罗莎, 黄璐瑶, 殷勤, 张钰莹, 赵燕, 张智胜

单位：1. 湖南农业大学 生物科学技术学院, 湖南 长沙 410128;；2. 湖南农业大学 南方粮油作物协同创新中心, 湖南 长沙 410128;；3. 湖南农业大学 农学院, 湖南 长沙 410128

关键词：乙醇酸氧化酶,酶学特性,同工酶电泳,菠菜,

基金：国家自然科学基金项目（31600193）；湖南省自然科学基金项目（2017JJ3109）；湖南省教育厅科学研究项目（17B123）；湖南农业大学人才科学基金项目（16QN22）

为了解析菠菜乙醇酸氧化酶（SpGLO）的酶学特性及同工酶谱。首先提取菠菜的RNA并反转录成cDNA，通过NCBI数据库中提供的菠菜GLO基因mRNA序列信息，设计特异性引物，扩增目标序列并连接到pMD19-T载体上进行测序鉴定；随后再次设计引物并在上游引物加入His标签，克隆SpGLO基因构建到pYES2载体上，将该载体转入酿酒酵母中进行表达并通过His-tag亲和柱纯化，然后在不同诱导时间点取样测定SpGLO酶活。结果显示，转化后的酿酒酵母菌株在诱导发酵20 h后能得到最高的GLO活性。以乙醇酸为底物测定SpGLO在不同pH、不同温度条件下的催化活性，其最适pH值为8.0，最适温度为39℃。然后分别以乙醇酸、乙醛酸、甘油酸为反应底物，系统分析了SpGLO的酶学特性，数据显示，SpGLO对乙醇酸的亲和力最高，其Km为0.41 mmol/L，Vm为45.92 μmol/（min·mg）。以乙醇酸、乙醛酸为底物，使用草酸抑制其催化活性，其Ki分别为4.61，2.09 mmol/L，表明以乙醛酸为底物时SpGLO的催化活性更易被草酸抑制。同时将纯化后的SpGLO通过Caps-氨水电泳体系进行同工酶电泳，经过染色后出现2条同工酶带，表明菠菜叶片中可能存在2种GLO同工酶。为将来深入研究植物GLO同工酶之间的生化特性差异并分析其不同生理功能奠定良好的基础。

来源：2019年第1期

《华北农学报》期刊编辑部

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